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發(fā)布時(shí)間: 2022-09-12 點(diǎn)擊次數(shù): 1355次理想的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小、重復(fù)性好、安全、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前轉(zhuǎn)染效率高的方法,同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法則各有其特點(diǎn)。免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)我們應(yīng)注意的一些要點(diǎn)如下:1.如為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必須應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%(貼壁細(xì)胞)或2×106-4×106細(xì)胞/ml(懸浮細(xì)胞)為宜,在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。2.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染,OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。3.培養(yǎng)基中的抗生素抗生素是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因?yàn)檫@些抗生素是選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng),使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。4.設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。5.一般在轉(zhuǎn)染24-48h,靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。6.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物,常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等。
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