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實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
細(xì)胞，可拍照的顯微鏡,Transwell小室,孔徑8μm,沒包被膠的Transwell,遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，BSA，正常的*培養(yǎng)基,無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結(jié)晶紫染液(0.1%PBS結(jié)晶紫)
Transwell操作步驟
01
用BD公司的Matrigel 1:8或者根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來決定稀釋,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。
02
制備細(xì)胞懸液前可先用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1%的血清培養(yǎng)細(xì)胞，讓細(xì)胞饑餓12-24h,進(jìn)一步去除血清的影響。
03
消化細(xì)胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1-2遍),用含0.1%的BSA的無血清培養(yǎng)基重懸及調(diào)整密度，通常調(diào)整細(xì)胞密度至5×10^5cells/ml。
04
取細(xì)胞懸液100μl加入Transwell上室, 也可以根據(jù)細(xì)胞生長速度進(jìn)行調(diào)整，操作小提示：接種劑量不同的細(xì)胞，其侵襲能力是不同的，細(xì)胞量過多，穿過膜的細(xì)胞會過多過快，最后會難以統(tǒng)計(jì)結(jié)果;而細(xì)胞量過少，可能還沒到檢測的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過，進(jìn)入下室。因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。
05
24孔板下室一般加入600μl含生長因子或血清的*培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就會減弱甚至消失,種板時(shí)一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起去除完氣泡,再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。若是平行孔，一般設(shè)置兩組.
06
培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)12-48h(主要依細(xì)胞侵襲能力而定)。24h較常見,時(shí)間節(jié)點(diǎn)的設(shè)置除了要考慮到細(xì)胞的侵襲力外,處理因素以及細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果步驟：
01
采用直接計(jì)數(shù)法,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當(dāng)風(fēng)干。
02
0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,注意不要蹭到已穿膜的那一層細(xì)胞，之后再用PBS洗3遍。
03
400倍顯微鏡下每個(gè)樣本取6-10個(gè)視野觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，統(tǒng)計(jì)分析。
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