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    如何從組織中分離制備細胞核基質/中間纖維支架結構？

    發(fā)布時間： 2021-11-18　　點擊次數(shù)： 946次

    材料與儀器

    新鮮組織
    NaCl 緩沖液 細胞骨架緩沖液
    Teflon 研杵 Doume 勻漿器

    步驟

    1. 在 4℃ 將新鮮組織切成 1 mm3 左右的小塊。在 4℃，用 Teflon 研杵和 Doume 勻漿器在含 0.5% Tritron X-100 的細胞骨架緩沖液中對切碎的組織進行勻漿，直到?jīng)]有可見的團塊。每克組織用大約 10 ml 緩沖液。

    含 0.5% Triton X-100 的細胞骨架緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    300 mmoI/L 蔗糖

    100 mmoI/L NaCI

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    2. 用一 250 μm 孔徑的尼龍濾器過濾勻漿?；|成分和沒有充分勻漿的團塊將留在濾器上。

    3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提 3~5 分鐘。

    抽提緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    250 mmol/L 硫酸銨

    300 mmol/L 蔗糖

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    4. 在含 0.5% Triion X-I00 的消化緩沖液中用無 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質 DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml，32℃ 反應 30~50 分鐘。

    含 0.5 % Triton X-100 的消化緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    50 mmol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    5. 用抽提緩沖液清洗樣品 5 分鐘。

    6. （可選）樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質核心的 10 nm纖絲分支顯形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每種酶400 單位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。

    2 mol/L NaCl 緩沖液：

    10 mmol/L PIPES，pH 6.8

    300 mmol/L 蔗糖

    2 mol/L NaCl

    3 mmol/L MgCl2

    1 mmol/L EGTA

    7. 固定核基質以進行免疫熒光檢測或電子顯微鏡檢測。


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